牛奶中蛋白質(zhì)的測定原理及其注意事項(xiàng)
摘要：本文主要針對應(yīng)用凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質(zhì)的原理及其具體的消化和蒸餾過程中分別應(yīng)注意的幾大問題加以介紹，以期對從事蛋白質(zhì)測定工作的檢測人員有一定的幫助。
關(guān)鍵詞：牛奶蛋白質(zhì) 測定原理 注意事項(xiàng)
蛋白質(zhì)對于人體具有構(gòu)成體內(nèi)原生質(zhì)和修補(bǔ)身體組織，并制造酶和激素等生命基礎(chǔ)物質(zhì)，調(diào)節(jié)生理機(jī)能的作用。蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物對食品的色、香、味和產(chǎn)品質(zhì)量都有一定的影響。蛋白質(zhì)的高低將直接決定食品的營養(yǎng)價值。牛奶作為人體*的蛋白質(zhì)供給源，屬于*蛋白質(zhì)，其中的8種人體必需氨基酸種類齊全，比例適當(dāng)。其蛋白質(zhì)含量達(dá)牛乳的3.4%左右，乳蛋白的消化吸收率一般為97%-98%，高于植物蛋白，而且消化速度又比肉、魚、蛋等動物性蛋白快。測定蛋白質(zhì)的方法很多，目前zui基本和zui常用的方法是先測定總氮量，再乘以不同食品的蛋白質(zhì)系數(shù)，即為食品中蛋白質(zhì)的含量。測定總氮量的方法目前國家標(biāo)準(zhǔn)仍采用凱氏定氮法為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法有常量法、半微量法和微量法等。其測定原理相同，主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，實(shí)
0 引 言
驗(yàn)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)。但微量法的準(zhǔn)確度和精密度比常量法要差一些。另外，還有雙縮脲法、紫外吸收光譜法、福林-酚試劑法、考馬斯亮藍(lán)染色法等，也常用于蛋白質(zhì)含量的測定，由于方法簡單快速，多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。近年來國外還推出了近紅外品質(zhì)測試儀對蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析的方法。但凱氏定氮法正由于它的諸多優(yōu)點(diǎn)而仍然應(yīng)用普遍。
1．測定原理
將含有蛋白質(zhì)的待測樣品同濃硫酸一起加熱消化，使氮變成氨，同時形成氨鹽，在消化液中加入過量的堿,再加熱將氨蒸餾出來,并收集于硼酸溶液中，zui后用酸堿滴定法測定其總氮量。
1.1 消化
樣品中含氮有機(jī)物與濃硫酸和催化劑一起加熱消化.使蛋白質(zhì)分解,分解的胺基氨與過量的硫酸結(jié)合生成硫酸胺留在溶液中，其主要反應(yīng)式為：
RCH.NH2COOH+H2SO4 ->CO2+SO2+NH3+H2O
2NH3+H2SO4->（NH4）2SO4
另外，催化劑硫酸銅在有機(jī)物全部消化后，溶液顯清澈透明的藍(lán)綠色，可用它來指示消化終點(diǎn)。此外，硫酸銅還可用做下一步蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑。 過氧化氫，為氧化劑，有助于有機(jī)物消化，同時可以消除消化過程中的氣泡現(xiàn)象。
1.2 蒸餾
消化終了后所有蛋白質(zhì)的氨態(tài)氮都轉(zhuǎn)化成銨鹽形式，硫酸銨在堿性條件下進(jìn)行蒸餾，將釋放出來的氨用硼酸溶液吸收，生成四硼酸氫銨．其反應(yīng)式：
（NH4）2SO4+2NaOH ->Na2SO4+2NH3+2H2O
NH3+4H3BO3 ->NH4HB4O7+5H2O
1.3 滴定
用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定產(chǎn)生的四硼酸氫銨，根據(jù)消耗鹽酸溶液的量計算樣品含氮量，然后換算成蛋白質(zhì)含量。
NH4HB4O7+HCL+5H2O ->NH4CL+4H3BO3
2.試劑與儀器
2.1 儀器及用具
凱氏燒瓶（500ml） 容量瓶（100ml）錐形瓶 酸式滴定管（25ml或50ml）
上海沛歐SKD-08S2消化爐 上海沛歐 SKD-100,200,600定氮儀（或定氮蒸餾裝置）
2.2試劑
試劑要求均為分析純，所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制
濃硫酸 凱氏定氮催化劑過氧化氫溶液（體積分?jǐn)?shù)為30%）
NaOH溶液：（C（NaOH）=400g/L稱取400gNaOH固體，用100ml除去CO2的蒸餾水溶解，待冷卻后移入試劑瓶內(nèi)）
硼酸溶液：（C（H3BO3）為40g/L.稱取20g固體硼酸，溶解于500ml熱蒸餾水中，搖勻備用）
甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑： （用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，將溴甲酚綠與甲基紅分別以2g/L溶于95%乙醇溶液中，使用時按5：1的比例混合）
鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：（C（HCL）=0.1000mol/L）
3. 操作過程的注意事項(xiàng)
3.1 消化
3.1.1凱氏定氮法的誤差，主要因消化操作的條件而產(chǎn)生，因此要格外注意。
4。結(jié)束語
3.1.2量取的樣品倒入凱氏燒瓶時，不要將樣品粘在瓶頸上，以免加入消化液后試樣炭化粘在瓶頸上消化不*．消化過程中要逐漸升溫，當(dāng)?shù)蜏丶訙刂脸霈F(xiàn)帶有硫酸的白色氣體后，才可升溫使溶液沸騰，但應(yīng)避免劇烈沸騰。
3.1.3消化過程中，消化液體積不可蒸至少于原來的三分之二，更不可蒸干，若硫酸損失過多，應(yīng)酌量補(bǔ)加硫酸。若取樣量較大，如干待測樣超過5克，可按每克試樣5毫升的比例增加硫酸用量?！ ?/span>
3.1.4當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%雙氧水2-3毫升后再繼續(xù)加熱消化。但在消化后期不得加入，因此消化液中還原物質(zhì)（如：碳）含量減少，氧化劑易造成氨進(jìn)一步氧化為氮逸出，使測定結(jié)果偏低。
3.1.5消化液澄清后，必須繼續(xù)加熱沸騰三十分鐘，以提高氮的回收率，若催化劑中有硒存在，加熱時間過長也可能使氮素?fù)p失。一般情況下，純牛奶需消化4.5小時即可。
3.2蒸餾
3.2.1．消化液加蒸餾水稀釋后，應(yīng)及時蒸餾，否則應(yīng)保存消化液，臨用時再加蒸餾水稀釋．反應(yīng)室加入堿液后，應(yīng)立即蓋塞并加水封，注意各接頭處的密封情況，防止漏氣。
3.2.2 甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑必須于臨用前按比例混勻，其在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。
3.2.3．蒸餾時，加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外，還與消化液中的硫酸和硫酸銅作用．反應(yīng)式：
2NaOH+H2SO4 ->Na2SO4+2H2O
2NaOH+CuSO4 ->Na2SO4+Cu（OH）2
Cu（OH）2 ->CuO +Cu（OH）2
若加入的氫氧化鈉不夠，則溶液呈藍(lán)色，不生成褐色的氫氧化銅沉淀．所以，加入的氫氧化鈉必須過量，并且動作還要迅速，以防止氨的流失。
3.2.4．蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水裝至三分之二體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，內(nèi)加甲基橙指示劑數(shù)滴，水應(yīng)呈橙紅色，如變黃時，應(yīng)該補(bǔ)加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出，使結(jié)果偏大。
3.2.5．因蒸餾時反應(yīng)至外層的氣壓大于反應(yīng)室內(nèi)的壓力，而反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸餾中不得?；饠鄽猓駝t，會發(fā)生倒吸。停止蒸餾時，由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應(yīng)室外層，所以，操作時，應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否*，可用精密ＰＨ試紙測冷凝管口的冷凝液來測定，中性則說明已蒸餾*。
3.2.6 在鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制時，必須將基準(zhǔn)無水碳酸鈉于270-300℃灼燒至恒重后稱取所須用量，否則也會影響蛋白質(zhì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
牛乳提供了人體必需的蛋白質(zhì)，而提供準(zhǔn)確可靠的蛋白質(zhì)含量則是食品檢驗(yàn)工作人員的必需技術(shù)，凱氏定氮法作為目前法定的國標(biāo)方法與我們的工作密不可分，本文主要通過綜述凱氏定氮法操作的注意事項(xiàng)而提供給關(guān)注此檢測方法的從業(yè)人員一定的幫助，與筆者和讀者會有一定提高。
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